Летом 1850 года Менделеев поступает на естественное отделение (физико-математический факультет) Главного педагогического института (располагался до 1859 года в здании Двенадцати коллегий). Для 16-летнего юноши сделали исключение: зачислили в институт  в не приёмный год с условием, что ему придётся обучаться на один год дольше.

Первые годы учёбы в институте оказались для Дмитрия очень тяжёлым временем. Осенью 1850 года  уходит из жизни его любимая мама, а вскоре от туберкулёза умирает и сестра Лиза. Дмитрий остаётся совершенно один. Нелегко даётся и обучение в институте: за первый курс почти по всем предметам он получает лишь удовлетворительные оценки и занимает из 27 только 25 место. Однако на старших курсах, благодаря своему неимоверному усердию, Дмитрий становится одним из лучших студентов: его среднегодовой бал равен 4,5 баллам (из пяти возможных).
Через всю свою жизнь Менделеев пронесёт чувство благодарности своим замечательным  преподавателям, сыгравшим огромную роль в его научном становлении. Среди них  были такие известные учёные, как академики и профессора Петербургского университета:  физик Э. Х. Ленц, химик А. А. Воскресенский, математик и механик  М. В. Остроградский, минералог М. С. Куторга и зоолог Ф. Ф. Брант. Развитию индивидуальных способностей юноши способствовала и сама  обстановка закрытого учебного учреждения: малое число студентов,  заботливое отношение со стороны преподавательского состава. Отягощало учёбу лишь слабое здоровье. Из-за сырого петербургского климата у Дмитрия обострилась чахотка (часто страдал приступами горлового кровотечения).Несмотря на слабое здоровье,  Дмитрий Менделеев в 1855 году блестяще сдаёт выпускные экзамены и заканчивает с золотой медалью  Главный педагогический институт, получив диплом старшего преподавателя. По совету врачей, считавших,  что юноша может  умереть от туберкулёза, он на некоторое время переезжает на юг. В Симферополе 21-летнему Дмитрию Менделееву удаётся попасть на приём к известному врачу Николаю Ивановичу Пирогову, который опровергает ранее высказанный страшный диагноз, назначает необходимое лечение и возвращает Менделеева к жизни. Проработав  полгода в Одессе учителем Ришельевской гимназии, Дмитрий в 1856 году возвращается в Петербург и защищает диссертацию на степень магистра химии «Об удельных объёмах». В 23 года Менделеев становится  приват-доцентом Императорского Санкт-Петербургского университета, где читает лекции сначала по теоретической, а потом по органической химии.

​